Lignin aromatics valorization by Pseudomonas putida : novel strategies to increase the production of mcl-polyhydroxyalkanoate and cis,cis-muconic acid

Ramirez-Morales, Juan Esteban; Rabaey, Korneel; Blank, Lars M.; Agler-Rosenbaum, Miriam

doi:10.18154/RWTH-2021-11234

Lignin aromatics valorization by Pseudomonas putida : novel strategies to increase the production of mcl-polyhydroxyalkanoate and cis,cis-muconic acid

Ramirez-Morales, Juan Esteban^RWTH*

2021 & 2022

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Juan Esteban Ramírez Morales M.Sc. Biochemical Engineering

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2021

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021. - Dissertation, Ghent University, 2021

Cotutelle-Dissertation. - Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2022

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Rabaey, Korneel (Thesis advisor) ; Agler-Rosenbaum, Miriam (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2021-10-26

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2021-11234
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/836318/files/836318.pdf

Einrichtungen

Projekte

SuPER-W - Sustainable Product, Energy and Resource Recovery from Wastewater (676070) (676070)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
lignin (frei) ; lignin aromatics (frei) ; lignin valorization (frei) ; PHA (frei) ; Pseudomonas putida KT2440 (frei) ; biological funneling (frei) ; biopolymer (frei) ; bioprocess development (frei) ; biorefining (frei) ; circular bioeconomy (frei) ; muconic acid (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Lignin, ein Hauptbestandteil der Lignocellulose-Biomasse, ist das am häufigsten vorkommende aromatische Polymer auf unserem Planeten. Somit stellt es eine erneuerbare und nicht fossile Quelle für Aromaten dar, die verspricht, den Übergang zu einer zirkulären Bioökonomie positiv zu beeinflussen. Obwohl es sich um eine wertvolle chemische Ressource handelt, wird Lignin immer noch nicht ausreichend genutzt. In den letzten Jahren hat sich ein Paradigmenwechsel bei der Implementierung neuer Bioraffinerien ergeben und es wird vermehrt Wert auf die chemo- und / oder biokatalytische Aufbereitung von Ligninaromaten zu wertvollen Produkten gelegt. Insbesondere bei der biokatalytischen Umwandlung verspricht die natürliche katabolische Fähigkeit vieler Pseudomonaden Aromaten zu nutzen, die inhärente aromatische Heterogenität von depolymerisierten Lignin-Gemischen zu erleichtern. Gleichzeitig können einige Pseudomomas-Stämme wertvolle Moleküle für die Polymerindustrie wie Polyhydroxyalkanoate mittlerer Kettenlänge (mcl-PHA) und cis,cis-Mukonsäure synthetisieren. Während durch Metabolic Engineering enorme Fortschritte bei der Verbesserung der Umwandlung von Aromaten in mcl-PHA erzielt werden, gibt es eine erhebliche Lücke im detaillierten Verständnis von Bioprozessen, insbesondere bei Gemischen von Aromaten aus Lignin. Analog dazu verhindern, trotz wichtiger Fortschritte bei der Stamm- und in der Bioprozessentwicklung, Limitationen durch toxische Effekte der Produktinhibierung immer noch, dass industriell relevante Produktivitäten von cis,cis-Mukonsäure aus Ligninsubstraten erreicht werden. Durch das Verständnis der Schlüsselfaktoren für eine erfolgreiche Biokonversion und deren Umsetzung in innovative Bioprozessstrategien sollte die Produktion von mcl-PHA und cis,cis-Mukonsäure aus Ligninaromaten gesteigert werden. Nach schrittweisen Screenings und vergleichenden Kultivierungen mehrerer bekannter Stämme der Pseudomonas-Familie bestätigte diese Arbeit eindeutig, dass Pseudomonas putida KT24440 der robusteste, vielseitigste und leistungsfähigste Biokatalysator für die Akkumulation von mcl-PHA aus einem definierten aromatischen Lignin-Gemisch ist. In einem nächsten Schritt wurde die detaillierte Aromatenverwertung und die mikrobielle Stoffwechselaktivität durch Online-Messungen des Sauerstoffverbrauchs aufgelöst. Durch diese Untersuchungen wurde die Verfügbarkeit von Sauerstoff und Stickstoff als Schlüsselfaktor für eine erfolgreiche biokatalytische Verbesserung identifiziert. Insgesamt wurde die Bildung von mcl-PHA im Wildtyp-Stamm unter technisch relevanten Bedingungen um bis zu 43% (mg mcl-PHA mg-1 CDW) verbessert. Die höchste mcl-PHA-Konzentration (582 mg L-1) wurde für ein C/N-Verhältnis von 60 unter Bedingungen ohne Sauerstofflimitierung erhalten (Sauerstoffübertragungsrate ≥ 20 mmol L-1 h-1). Im Gegensatz dazu akkumulierten aromatische Zwischenprodukte unter sauerstofflimitierten Bedingungen bei Sauerstoffübertragungsraten unter 10 mmol L-1 h-1. Durch diese Bioprozess-Charakterisierung wurde die Leistungsfähigkeit des biokatalytischen Aromatenumwandlung in P. putida KT2440 vorhersehbar und die experimentellen Bedingungen basierend auf der Sauerstoffübertragungsrate in einen 1-l-Rührkessel-Bioreaktor skalierbar. Schließlich wurden die Vorteile von Strategien zur gleichzeitigen Optimierung von Biokatalysatoren und Bioprozessen demonstriert. Eine 1,9-fache Erhöhung der mcl-PHA-Konzentration und eine 1,5-fache Erhöhung des mcl-PHA-Gehalts wurden aus Ligninaromaten erzielt. Um den negativen, toxischen Effekt der Produktakkumulation von cis,cis-Mukonsäurezu mildern, wurde in dieser Arbeit auch eine innovative Lösung zur Inline-Extraktion von cis,cis-Mukonat etabliert, das von einem genetisch verändertem Stamm von P. putida KT2240 gebildet wird. Die Umsetzung folgte einem systematischen Ansatz der Prozessentwicklung. Zunächst wurde eine elektrolytische Extraktion von cis,cis-Mukonat hinsichtlich Rate und Coulombischer-Effizienz aus einem synthetischen Medium charakterisiert. Parallel dazu wurden die Bioproduktionsraten von cis,cis-Mukonsäure in einem herkömmlichen Bioprozessen definiert und die negative Wirkung von cis, cis-Mukonsäure auf die Kultur bei einer Schwellenkonzentration von 195 mM (27,7 g L-1) bestätigt. Anschließend wurden elektrolytische Langzeitextraktionen in höherem Maßstab unter Verwendung von Fermentationsbrühen als Annäherung an den Endprozess durchgeführt. Diese Erfahrung diente dazu, relevante technische Nachteile im Zusammenhang mit der Ausfällung von Mukonsäure in der anodischen Kammer zu identifizieren und zu lösen. Die Lösung bestand aus einer pH-Kontrolle bei 3,5, was ein geeigneter pH war, bei dem höhere Mengen der Mukonsäureisomere cis,cis- und cis,trans- in Lösung gefunden wurden (d. h. nicht als ausgefällte Form). Dies war entscheidend, um eine stärkere Anreicherung von Mukonat im Anolyten zu ermöglichen. Basierend auf allen Prozessparametern (d. h., den Bioproduktionsraten und der extraktiven Elektrolyseleistung), die aus den getrennten Schritten erhalten wurden, wurde eine endgültige Prozessintegration abgeleitet. Durch die Durchführung der InLine-Extraktion aus einem Bioreaktor wurde die volumetrische Produktivität von cis,cis-Muonat gegenüber einem herkömmlichen parallel laufenden Bioprozess um 15,6% erhöht.Insgesamt trägt diese Studie dazu bei, unser Verständnis der biokatalytischen Fähigkeit des vielversprechenden Bakteriums P. putida KT2440 zur effizienten Umwandlung von Ligninaromaten für zukünftige Bioraffinerieanwendungen zu vertiefen. Darüber hinaus wurde erstmals in einer mikrobiellen Kultivierung das Potenzial der selektiven Entfernung von cis,cis-Muconsäure nachgewiesen, was einen wichtigen Schritt zur Etablierung eines kostengünstigen Bioproduktionssystems darstellt.

Lignin, a major component of lignocellulosic biomass, is the most abundant aromatic polymer on the planet. Thus, it represents a renewable and non-fossil source of aromatics, promising to positively impact the transition to a circular bioeconomy. Despite being a chemical treasure box, lignin is still widely underutilized. In the last years, there is an emerging paradigm change towards implementing new biorefineries based on chemo- and/or biocatalytic upgrading of lignin aromatics into valuable products. Especially, in the biocatalytic conversion, the native aromatic catabolic ability of many Pseudomomas promises to ease the inherent aromatic heterogeneity of lignin depolymerized mixtures. Simultaneously, some Pseudomomas strains can synthesize valuable molecules for the polymer industry like medium chain length polyhydroxyalkanoate (mcl-PHA) and cis,cis-muconic acid. While enormous progress is underway in metabolic engineering towards improving conversion of aromatics into mcl-PHA, there is a significant gap in detailed bioprocess understanding, especially from mixtures of lignin-derived aromatics. Analogously, despite important advances on strain engineering and bioprocess development, limitations related to product accumulation at toxic levels still prevents reaching industrially-relevant productivities of cis,cis-muconic acid from lignin substrates. Thus, through understanding the key factors for successful bioconversion and applying this knowledge to implement innovative bioprocess strategies, this thesis intended to increase production of mcl-PHA and cis,cis-muconic acid from lignin aromatics. After performing step-wise screenings and parallel cultivations of several known strains of the Pseudomonas family, this work clearly confirmed Pseudomonas putida KT24440 as the most robust, versatile, and well performing biocatalyst for mcl-PHA accumulation from a defined lignin aromatic mixture. In a next step, the detailed resolution of aromatics funneling and microbial metabolic activity was revealed during online measurements of the oxygen consumption. From this experience, oxygen and nitrogen availability were identified as the key factors for a successful biocatalytic upgrading. Overall, the accumulation of mcl-PHA was improved in the wild type strain under technically relevant conditions by up to 43% (polymer content in cell biomass, mg mcl-PHA mg-1 CDW). At this stage, the highest mcl-PHA concentration (582 mg L-1) was obtained for a C/N ratio of 60 for oxygen-unlimited conditions (oxygen transfer rate ≥ 20 mmol L-1 h-1). In contrast, aromatic intermediates accumulated under oxygen-limited conditions at oxygen transfer rates below 10 mmol L-1 h-1. Through this bioprocess characterization, the performance of the biocatalytic funneling in P. putida KT2440 became predictable and thus, the experimental conditions were scalable into a 1-L stirred tank bioreactor based on the oxygen transfer rate. Finally, the benefits of implementing simultaneous biocatalyst and bioprocess optimization strategies were demonstrated. A 1.9-fold increment in mcl-PHA concentration and a 1.5-fold increment in mcl-PHA content were obtained from lignin aromatics. To alleviate the negative effect of product accumulation at toxic levels, this thesis also implemented an innovative solution establishing an in-line extraction of cis,cis-muconate produced by a metabolically engineered strain of P. putida KT2240. The implementation followed a systematic approach of process development. First, an electrolytic extraction of cis,cis-muconate was characterized in terms of flux and Coulombic efficiency from a synthetic media. In parallel, cis,cis-muconic acid bioproduction rates were defined in a conventional process and the negative effect of cis,cis muconic acid on the culture was confirmed at a threshold concentration of 195 mM (27.7 g L-1). In the middle time, long term electrolytic extractions were performed at a higher scale using fermentation broths as approximation of the final process. This experience served to identify and solve relevant technical drawbacks related to muconic acid precipitation in the anodic chamber. The solution consisted of pH control at 3.5, which was a suitable pH where higher amounts of the muconate isomeric forms cis,cis- and cis,trans- were found in solution (i.e., not as precipitated form). This was essential to enable higher muconate accumulation in the anolyte. From all the process parameters (i.e., bioproduction rates and extractive electrolytic performance) obtained separately, a final integration was carried out. Through implementing the in-line extraction from a bioreactor, the volumetric productivity of cis,cis-muconate was increased 15.6 % in respect to a conventional bioprocess run in parallel. Overall, this study contributed to deepening our understanding of the biocatalytic capability of the promising bacterium P. putida KT2440 towards efficient conversions of lignin aromatics for future biorefinery applications. Additionally, the potential of selective removal of cis,cis-muconic acid was demonstrated for the first time in a microbial cultivation, contributing as an important step towards implementing a cost-effective bioproduction system.

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